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  • 金達陽光

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    細胞凋亡實驗步驟及注意事項

    金達陽光 ? 2015-01-26 11:40:27 ? 來源:51jinda.com ? 點擊:3224

    一、實驗目的

    1、掌屋凋亡細胞的形態特征

     2、學會用熒光探針對細胞進行雙標記來檢測正?;罴毎?、凋亡細胞和壞死細胞的方法

    二、實驗原理

    細胞死亡根據其性質、起源及生物學意義區分為凋亡和壞死兩種不同類型。凋亡普遍存在于生命界,在生物個體和生存中起著非常重要的作用。它是細胞在一定生理條件下一系列順序發生事件的組合,是細胞遵循一定規律自己結束生命的自主控制過程。細胞凋亡具有可鑒別的形態學和生物化學特征。

    在形態上可見凋亡細胞與周圍細胞脫離接觸,細胞變園,細胞膜向內皺縮、胞漿濃縮、內質網擴張、細胞核固縮破裂呈團塊狀或新月狀分布、內質網和細胞膜進一步融合將細胞分成多個完整包裹的凋亡小體,凋亡小體最后被吞噬細胞吞噬消化。在凋亡過程中細胞內容物并不釋放到細胞外,不會影響其它細胞,因而不引起炎癥反應。

    在生物化學上,多數細胞凋亡的過程中,內源性核酸內切酶活化,活性增加。核DNA隨機地在核小體的連接部位被酶切斷,降解為180-200bp或它的整倍數的各種片斷。如果對核DNA進行瓊脂糖電泳,可顯示以180-200bp為基數的DNA ladder(梯狀帶紋)的特征。

    相比之下,壞死是細胞處于劇烈損傷條件下發生的細胞死亡。細胞在壞死早期即喪失質膜完整性,各種細胞器膨脹,進而質膜崩解釋放出其中的內容物,引起炎癥反應,壞死過程中細胞核DNA雖也降解,但由于存在各種長度不等的DNA片斷,不能形成梯狀帶紋,而呈彌散狀。

    一些溫和的損傷刺激及一些抗腫瘤藥物可誘導細胞凋亡,通常這些因素在誘導凋亡的同時,也可產生細胞壞死,這取決于損傷的劇烈程度和細胞本身對刺激的敏感程度。

    三尖杉酯堿(HT)是我國自行研制的一種對急性粒細胞白血病,急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內作用2小時,即可誘導HL-60細胞凋亡,并表現出典型的凋亡特征。本實驗用1μg/ml HT在體外誘導培養的HL-60細胞發生凋亡,同時也有少數細胞發生壞死。用Hoechst33342和碘化丙啶(propidium iodide,PI)對細胞進行雙重染色,可以區別凋亡、壞死及正常細胞。

    細胞膜是一選擇性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿過質膜。當細胞壞死時,質膜不完整,PI就進入細胞內部,它可嵌入到DNA或RNA中,使壞死細胞著色,凋亡細胞和活細胞不著色。而一些活細胞染料由于為親脂性物質,可跨膜進入活細胞,因而可進行活細胞染色。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較弱,它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與DNA特異結合(主要結合于A-T)堿基區),顯示凋亡細胞和活細胞。凡是看到有凋亡小體的細胞都是凋亡細胞。

    三、實驗用品

    1、試劑:三尖杉酯堿(HT),300μg/ml,100mmol/L Tris-HCl(pH7.5),5mol/L EDTA緩沖液、堿性裂解液:0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸鈉:3mol/L KAc(pH4.8);異丙醇;70%乙醇;溴酚藍,蔗糖指示劑。TBE電泳緩沖液,1%瓊脂糖,溴乙錠。PI母液:500μg/ml;Ho33342母液:2mmol/L。

     2、儀器設備:熒光顯微鏡,電泳儀,電泳槽,微量加樣器(1ml,100μl)0.5、1.5ml離心管,載玻片,蓋玻片。

    四、實驗材料

    人早幼粒白血病HL-60細胞,用含10%小牛血清的RPMI1640培養基在37℃,5%CO2條件下培養。

    五、方法步驟

    1、三尖杉酯堿誘發HL-60細胞凋亡

    (1)實驗前約24小時,接種兩瓶HL-60細胞,標記①、②,每瓶含約6ml培養液,置37℃,5%CO2培養箱培養。

    (2)實驗前約2.5小時,當細胞密度達到70%,①號瓶加入三尖杉酯堿200μl,使終濃度為1μg/ml,②號瓶中加入同等量PBS(pH7.4)作對照。共同放入培養箱中繼續培養2.5小時。

    2、Ho33342和PI雙重染色鑒別三種細胞

    (1)染色:將瓶中的細胞搖勻取200μl于1.5ml的離心管中,加入Ho33342母液2μl,PI 20μl,染色15分鐘。

    (2)滴片:取一載玻片用雙面膠圍成一小室,從離心管中各取以上染色后的細胞懸液10μl,加入小室內蓋上蓋玻片,熒光鏡下用紫外激發光,高倍鏡下觀察,區別三種細胞,并注意三者比例。

    六、注意事項

    1、誘導培養HL-60細胞時間要準確;

    2、熒光顯微鏡下觀察細胞時,由于熒光易碎滅,觀察時要盡量快。

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