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  • 金達陽光

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    凝膠層析法脫鹽和分離蛋白質

    金達陽光 ? 2015-01-26 11:13:53 ? 來源:51jinda.com ? 點擊:343

    (一)原理

    凡鹽析所獲得的粗制蛋白質(鹽析得到的IgG)中均含有硫酸銨等鹽類,這類將影響以后的純化,所以純化前均應除去,此過程稱為“脫鹽”(desalthing)。脫鹽常用透析法和凝膠過濾法,這兩種方法各有利弊。前者的優點是透析后析品終體積較小,但所需時間較長,且鹽不易除盡;凝膠過濾法則能將鹽除盡,所需時間也短,但其凝膠過濾后樣品體積較大。所以,要根據具體情況選擇使用。前實驗中樣品體積較小,凝膠達濾后樣品體積不會太增加,所以選用凝膠過濾法。

    (二)試劑與器材

    (1)Sephadex G-25。

    (2)0.0175mol/L,pH6.7磷酸鹽緩沖液。

    (3)奈氏(Nessler)試劑:于500ml錐形瓶內加入碘化鉀150g,碘110g,汞150g及蒸餾水100ml。用力振蕩7~15min,至碘的棕色開始轉變時,混合液溫度升高,將此瓶浸于冷水內繼續振蕩,直到棕色的碘轉變為帶綠色的碘化鉀汞液為止。將上清液傾入2000ml量筒內,加蒸餾水至2000ml,混勻備用。

    (4)20%(W/V)磺基水楊酸溶液。

    (5)1.5cm×20cm層析柱。

    (6)黑、白比色磁盤。

    (三)操作

    (1)取層析柱1支(1.5cm×20cm),垂直固定在支架上,關閉下端出口。將已經溶脹好的Sephadex G-25中的水傾倒出去,加入2倍體積的0.0175mol/L,pH6.7磷酸鹽緩沖液,并攪拌成懸浮液,然后灌注入柱,打開柱的下端出口,繼續加入攪勻的Sephadex G-25,使凝膠自然沉降高度到17cm左右,關閉出口。待凝膠柱形成后,在洗脫瓶中加入0.0175mol/L,pH6.7磷酸鹽緩沖液以3倍柱體積的磷酸鹽緩沖流過凝膠柱,以平衡凝膠。

    (2)凝膠平衡后,用皮頭滴管除去凝膠柱面的溶液,將鹽析所得全部IgG樣品加到凝膠柱表面,打開柱下口,控制流速讓IgG樣品溶液慢慢浸入凝膠內。凝膠柱面上加一層的0.0175mol/L,pH6.7磷酸鹽緩沖液,并用此緩沖液洗脫,控制流速為0.5ml/min左右。用試管收集洗脫液,每管10滴。

    (3)在開始收集洗脫液的同時檢查蛋白質是否已開始流出。為此,由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盤中,加入1滴20%磺基水楊酸,若呈現白色絮狀沉淀即證明已有蛋白質出現,直到檢查不出白色沉淀時,停止收集洗脫液。

    (4)由經檢查含有蛋白質的每管中,取1滴溶液,放置在白色比色盤孔中,加入1滴奈氏試劑,若呈現棕黃色沉淀說明它含有硫酸銨。合并檢查后不含硫酸銨的各管收集液,即為“脫鹽”后的IgG。

    注意:在檢測時,用皮頭滴管吸取管中溶液后應及時洗凈,再吸取下一管,以免造成相互污染假象。

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