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  • 金達陽光

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    逆轉錄-聚合酶鏈反應實驗方法

    金達陽光 ? 2015-01-26 11:08:40 ? 來源:51jinda.com ? 點擊:697

    逆轉錄-聚合酶鏈反應 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取組織或細胞中的總RNA,以其中的mRNA作為模板,采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增,而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數量級,使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術主要用于:分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統。

    一、反轉錄酶的選擇

    1. Money 鼠白血病病毒(MMLV)反轉錄酶:有強的聚合酶活性,RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37℃。

    2.禽成髓細胞瘤病毒(AMV)反轉錄酶:有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃。

    3.Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩定性反轉錄酶:在Mn2+存在下,允許高溫反轉錄RNA,以消除RNA模板的二級結構。

    4.MMLV反轉錄酶的RNase H-突變體:商品名為Superscript 和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉換成cDNA,這一特性允許從含二級結構的、低溫反轉錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。

    二、合成cDNA引物的選擇

    1.   隨機六聚體引物:當特定mRNA由于含有使反轉錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時,可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時,體系中所有RNA分子全部充當了cDNA第一鏈模板,PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。

    2.   Oligo(dT):是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數真核細胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾,此引物與其配對,僅mRNA可被轉錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%,故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數量和復雜性方面均要小。

    3.   特異性引物:最特異的引發方法是用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物,若PCR反應用二種特異性引物,第一條鏈的合成可由與mRNA 3’端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產生所需要的cDNA,導致更為特異的PCR擴增。

    三、 試劑準備

    1.RMA提取試劑

    2.第一鏈cDNA合成試劑盒

    3.dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

    4.Taq DNA聚合酶

    四、操作步驟

    1. 總RNA的提?。阂娤嚓P內容。

    2. cDNA第一鏈的合成:目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售,其原理基本相同,但操作步驟不一?,F以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System  for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。

    ① 在0.5ml微量離心管中,加入總RNA 1-5μg,補充適量的DEPC H2O使總體積達11μl。在管中加10μM Oligo(dT)12-18 1μl,輕輕混勻、離心。

    ② 70℃加熱10min,立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。

    然后加入下列試劑的混合物:10×PCR buffer  2μl;25mM MgCl2  2μl;10mM dNTPmix 1μl;0.1M DTT  2μl

    輕輕混勻,離心。42℃孵育2-5min。

    ③ 加入SuperscriptⅡ1μl ,在42℃水浴中孵育50min。

    ④ 于70℃加熱15min以終止反應。

    ⑤ 將管插入冰中,加入RNase H 1μl ,37℃孵育20min,降解殘留的RNA。-20℃保存備用。

    3.PCR:

    ① 取0.5ml PCR管,依次加入下列試劑:第一鏈cDNA   2μl;上游引物(10pM) 2μl;下游引物(10pM) 2μl;dNTP(2mM) 4μl;10×PCR buffer 5μl;Taq 酶(2u/μl) 1μl。

    ② 加入適量的ddH2O,使總體積達50μl。輕輕混勻,離心。

    ③ 設定PCR程序。在適當的溫度參數下擴增28-32個循環。為了保證實驗結果的可靠與準確,可在PCR擴增目的基因時,加入一對內參(如G3PD)的特異性引物,同時擴增內參DNA,作為對照。

    ④ 電泳鑒定:行瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察結果。

    ⑤ 密度掃描、結果分析:采用凝膠圖像分析系統,對電泳條帶進行密度掃描。

    五、注意事項

    1.在實驗過程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中,注意避免mRNA的斷裂。

    2. 為了防止非特異性擴增,必須設陰性對照。

    3.內參的設定:主要為了用于靶RNA的定量。常用的內參有G3PD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、β-Actin(β-肌動蛋白)等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。

    4. PCR不能進入平臺期,出現平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標DNA起始的數量有關。故對于每一個目標序列出現平臺效應的循環數,均應通過單獨實驗來確定。

    5. 防止DNA的污染:① 采用DNA酶處理RNA樣品;② 在可能的情況下,將PCR引物置于基因的不同外顯子,以消除基因和mRNA的共線性。

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