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  • 金達陽光

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    質粒DNA的提取與純化

    金達陽光 ? 2015-01-26 11:07:12 ? 來源:51jinda.com ? 點擊:213

    一、實驗目的與原理

    質粒多為一些雙鏈、環狀的DNA分子,是獨立于細菌染色體之外進行復制和遺傳的輔助性遺傳單位。質粒是進行分子生物學實驗操作,進行遺傳工程改良物種等工作時最主要的DNA載體。

    提取質粒的基本步驟分為三步:

    ①細菌的培養和質粒的擴增

    ②細菌菌體的裂解

    ③質粒DNA的純化

    本實驗采取的菌體裂解方法為堿解法,質粒純化方法為梯度離心法。

    二、材料與試劑

    1、材料:大腸桿菌

    2、儀器:超凈工作臺,培養箱,搖床,恒溫水浴鍋,臺式離心機,取液器一套,低溫冰箱,冷凍真空干燥機,電泳儀,水平電泳槽,紫外觀測儀

    3、試劑:

    Solution I 25 mM Tris-Hcl(pH7.4)

    10 mM EDTA(pH8.0)

    50 mM葡萄糖

    高壓滅菌,4℃保存

    Solution II 0.2 M NaOH, 1%SDS 現配現用

    Solution III 5 N KAc pH4.8

    高壓滅菌,4℃保存

    3 M NaAc PH5.2, 高壓滅菌,4℃保存。異丙醇,溶菌酶(8 mg/ml),酚/氯仿,無水乙醇,70%乙醇,LB培養基,電泳試劑三、操作步驟

    1、細菌繁殖

    LB培養基,2 ml/20ml,37℃,200rpm,搖一搖,過夜

    2、離心10 min,5000 rpm, 4℃;棄上淸液

    3、沉淀(菌體細胞)預冷的TES緩沖液洗滌,離心10 min,5000 rpm, 4℃

    加入預冷的1 ml Solution I,冰浴,10 min

    4、重新懸浮,加入150 ul溶菌酶母液,室溫放置5 min

    5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴,5 min

    6、加入0.9 ml預冷乙酸鉀,混勻,離心10 min,12000 rpm, 4℃

    7、加入1.5 ml異丙醇,-20℃冰箱內放置15 min

    8、離心10 min,12000 rpm, 4℃

    9、取沉淀,懸于400 ul TE緩沖液中

    10、加入40 ul,3 M NaAc

    11、酚/氯仿,抽提,乙醇沉淀

    12、離心10 min,12000 rpm, 4℃

    13、取沉淀,冷凍干燥,再懸浮于50 ul TE緩沖液中。

    14、電泳檢測提取DNA的質量

    四、結果與分析

    超螺旋結構DNA

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