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  • 金達陽光

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    實時熒光定量PCR具體實驗步驟

    金達陽光 ? 2015-01-26 11:05:59 ? 來源:51jinda.com ? 點擊:511

    1 樣品RNA的抽提

    ①取凍存已裂解的細胞,室溫放置5分鐘使其完全溶解。

    ②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿,蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后,15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相,中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。

    ③RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,混勻后15到30℃孵育10分鐘后,于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。

    ④RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀?;靹蚝?,4℃下7000rpm離心5分鐘。

    ⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

    ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時,先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次,使其完全溶解,獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

    2 RNA質量檢測

    1)紫外吸收法測定

    先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后,讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值,測定RNA溶液 濃度和純度。

    ① 濃度測定

    A260下讀值為1表示40 ?g RNA/ml。樣品RNA濃度(?g/ml)計算公式為:A260 ×稀釋倍數× 40 ?g/ml。具體計算如下:

    RNA溶于40 ?l DEPC水中,取5ul,1:100稀釋至495?l的TE中,測得A260 = 0.21

    RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l

    取5ul用來測量以后,剩余樣品RNA為35 ?l,剩余RNA總量為:

    35 ?l × 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g

    ②純度檢測

    RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度,比值范圍1.8到2.1。

    2)變性瓊脂糖凝膠電泳測定

    ①制膠

    1g瓊脂糖溶于72ml水中,冷卻至60℃,10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

    10×MOPS電泳緩沖液

    濃度  成分

    0.4M  MOPS,pH 7.0

    0.1M  乙酸鈉

    0.01M  EDTA

    灌制凝膠板,預留加樣孔至少可以加入25 ?l溶液。膠凝后取下梳子,將凝膠板放入電泳槽內,加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。

    ②準備RNA樣品

    取3?gRNA,加3倍體積的甲醛上樣染液,加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10?g/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

    ③電泳

    上樣前凝膠須預電泳5min,隨后將樣品加入上樣孔。5-6V/cm電壓下2h,電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2-3cm。

    ④紫外透射光下觀察并拍照

    28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類型),上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質,可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現DNA污染,將會在28S核糖體RNA帶的上面出現,即更高分子量的彌散遷移物質或者帶,RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。

    3 樣品cDNA合成

    ①反應體系

    序號  反應物  劑量

    1  逆轉錄buffer  2μl

    2  上游引物  0.2μl

    3  下游引物  0.2μl

    4  dNTP  0.1μl

    5  逆轉錄酶MMLV  0.5μl

    6  DEPC水  5μl

    7  RNA模版  2μl

    8  總體積  10μl

    輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。

    ②混合液在加入逆轉錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘,取出后立即冰水浴至管內外溫度一致,然后加逆轉錄酶0.5μl,37℃水浴60分鐘。

    ③取出后立即95℃干浴3分鐘,得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液,保存于-80℃待用。

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