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  • 金達陽光

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    蛋白質測序

    金達陽光 ? 2015-01-15 09:32:30 ? 來源:51jinda.com ? 點擊:126

    一、概念

    當前,所謂蛋白質測序,主要指的是蛋白質的一級結構的測定。蛋白質的一級結構(Primary structure)包括組成蛋白質的多肽鏈數目。很多場合多肽和蛋白質可以等同使用。多肽鏈的氨基酸順序,它是蛋白質生物功能的基礎。
      
    蛋白質氨基酸順序的測定是蛋白質化學研究的基礎。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結構以來,現在已經知道約十萬個不同蛋白質的一級結構。

    二、測定步驟

    1 多肽鏈的拆分。由多條多肽鏈組成的蛋白質分子,必須先進行拆分。幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起,稱為寡聚蛋白質,如,血紅蛋白為四聚體,烯醇化酶為二聚體;可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理,即可分開多肽鏈(亞基).

    2 測定蛋白質分子中多肽鏈的數目。通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數與蛋白質分子量之間的關系,即可確定多肽鏈的數目。

    3 二硫鍵的斷裂。幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯在一起,可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下,用過量的β-巰基乙醇處理,使二硫鍵還原為巰基,然后用烷基化試劑保護生成的巰基,以防止它重新被氧化。

    二硫鍵的切割與保護(元素后數字為下標)

    a 過甲酸〔performic acid〕 不可逆

    -CH2SO3H

    b、還原+氧化 不可逆

    [ 巰基乙醇,DTT ] + 碘乙酸等

    -S-CH2-COOH

    c、亞硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆

    -R1-S-S-R2 + HSO3-

    R1-S- + R2-S-SOH3

    可以通過加入鹽酸胍的方法解離多肽鏈之間的非共價力;應用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。

    巰基(-SH)的保護

    作用:這些反應(見下圖)可用于巰基的保護。

    4 測定每條多肽鏈的氨基酸組成,并計算出氨基酸成分的分子比(如下圖)

    5 分析多肽鏈的N-末端和C-末端

    多肽鏈端基氨基酸分為兩類:N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。在肽鏈氨基酸順序分析中,最重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法(Sanger法;Edman法;DNS-Cl;酶降解法),C末端分析法(肼解法;酶降解法;硼氫化鋰法)。

    6 多肽鏈斷裂成多個肽段??刹捎脙煞N或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片,并將其分離開來。

    7 測定每個肽段的氨基酸順序

    8 確定肽段在多肽鏈中的次序。

    利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊,拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。

    9 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置

    一般采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈,再利用雙向電泳技術分離出各個肽段,用過甲酸處理后,將可能含有二硫鍵的肽段進行組成及順序分析,然后同其它方法分析的肽段進行比較,確定二硫鍵的位置。


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